Koks yra šarminės proteazės aktyvumo nustatymo metodas?
Koks yra šarminės proteazės aktyvumo nustatymo metodas?
Fermento aktyvumas reiškia fermento gebėjimą katalizuoti tam tikras chemines reakcijas. Fermento aktyvumo dydį galima išreikšti tam tikros cheminės reakcijos, kurią jis katalizuoja atitinkamomis sąlygomis, greičiu. Liaoningo šarminės proteazės fermento aktyvumo matavimas iš tikrųjų matuoja fermento katalizuojamos cheminės reakcijos greitį. Fermentinės reakcijos greitis gali būti išreikštas reakcijos substrato sumažėjimu arba produkto padidėjimu per laiko vienetą. Jautrumo sumetimais paprastai matuojamas pagaminto produkto kiekis per laiko vienetą. Kadangi fermentinės reakcijos greitis bėgant laikui gali palaipsniui mažėti, norint teisingai išmatuoti fermento aktyvumą, reikia nustatyti pradinį fermentinės reakcijos greitį.
Šarminės proteazės aktyvumo nustatymo principas Folino metodo principas
Šarminė proteazė šarminėmis sąlygomis gali katalizuoti kazeino hidrolizę į tiroziną. Tirozinas yra aminorūgštis, turinti fenolio hidroksilo grupę ir gali reaguoti su Folinu (fosforungstinės rūgšties ir fosfomolibdino rūgšties mišiniu). (Folino fenolio reakcija: Folino reagentas yra labai nestabilus esant šarminėms sąlygoms. Fenolio junginiais jį nesunku kiekybiškai sumažinti, gaunant volframo mėlynos ir molibdeno mėlynos spalvos mišinį, parodantį skirtingą mėlynos spalvos atspalvį.) Naudojant kolorimetriją, tai yra Galima nustatyti pagaminto tirozino kiekį, o fermento aktyvumui išreikšti naudojamas tirozino kiekis, gautas hidrolizuojant kazeiną Liaoning šarminės proteazės būdu per vienetą, tokiu būdu apskaičiuojant fermento aktyvumą.
Šarminės proteazės aktyvumo nustatymo eksperimentinė procedūra
Fermento tirpalo paruošimas: tiksliai pasverkite 1 g (± 0,001) sausų fermento miltelių, įpilkite 10 ml buferinio tirpalo (2.2.5), ištirpinkite mažoje stiklinėje ir išmaišykite stikline lazdele. Po kurio laiko stovint, atsargiai supilkite viršutinio sluoksnio tirpalą į matavimo kolbą. Į vidurį į nuosėdų dalį įpilkite nedidelį kiekį buferinio tirpalo, tokiu būdu išmaišykite ir ištirpinkite 4 kartus, o galiausiai viską supilkite į 100 ml matavimo kolbą. . Praskiedžiama iki žymės buferiniu tirpalu, gerai suplakite ir filtruokite keturiais marlės sluoksniais. Paimkite 5 ml filtrato, perpilkite jį į 100 ml matavimo kolbą, praskieskite distiliuotu vandeniu iki žymės ir praskieskite fermento skystį 2000 kartų.
Šarminės proteazės aktyvumo apibrėžimas
Šarminės proteazės aktyvumo vieneto apibrėžimas: 1 gramas šarminės proteazės miltelių gali pagaminti 1 mikrogramą tirozino per minutę, esant pH 10 ir 40 ° C, kuris laikomas fermento aktyvumo vienetu.
Atsargumo priemonės nustatant šarminės proteazės aktyvumą
1. Fermento reakcijos temperatūra, pH ir laikas turi tiesioginį poveikį hidrolizuotų peptidų jungčių skaičiui, todėl jis turi būti griežtai kontroliuojamas.
2. Užbaigus reakciją trichloracto rūgštimi, filtratas, gautas filtruojant reakcijos mišinį, turi būti skaidrus.
3. Kadangi Folino reagentas yra jautrus rūgščiai aplinkai ir yra linkęs keistis, matavimo metu nustatyta tvarka. Būtina įpilti natrio karbonato tirpalo, kad susidarytų šarminė aplinka, tada įpilkite Folino reagento, kad jis normaliai veiktų.
Aukščiau yra susiję straipsniai apie šarminę proteazę, kuriuos aš jums pasidaliniau. Jei norite sužinoti kitų susijusių straipsnių apie šarminę proteazę, susisiekite su mumis.
