Bacillus Subtilis tyrimas pašarų mikrobų preparatuose

ICS 65.120                                                                                                                  CKlasifikacijos Nr.: B 46

GB/T 26428-2010

PKinijos Respublikos nacionaliniai standartai

Bacillus Subtilis sklaidos kanaluose tikrinimo standartas

Išleista: 2011-01-14                                                                                  

Įgyvendinta: 2011-07-01 

Išdavė:PKinijos Respublikos bendroji kokybės priežiūros, tikrinimo ir karantino administracija bei Kinijos nacionalinis standartizacijos valdymo komitetas

Pratarmė

Šis standartas parengtas pagal GB/T 1.1-2009 taisykles.

Šis standartas priklauso Nacionalinio pašarų pramonės standartizacijos techninio komiteto (SAC/TC 76) jurisdikcijai.

Šį standartą pasiūlė ir parengė: Guangdongo provincijos mikrobiologinės analizės ir tyrimų centras.

Pagrindiniai šio standarto rengėjai: Honghui Zhu, Xiaotang Sun, Songzhen Yang, Yuanliang Chen ir Xianjiao Zhang.

Bacillus Subtilis tyrimas pašarų mikrobų preparatuose

1. Taikymo sritis

Šis standartas apibrėžia bacillus subtilis tyrimų pašarų mikrobų preparatuose taisykles.

Šis standartas taikomas tiriant ir skaičiuojant bacilus subtilis pašarų mikrobų preparatuose.

2. Norminės nuorodos

Taikant šį dokumentą būtini šie dokumentai. Nuorodoms su data šiam dokumentui taikoma tik versija su data. Cituotiems dokumentams be datos šiam dokumentui taikoma naujausia versija (įskaitant visus pakeitimus):

GB/T 8170 skaičių apvalinimo taisyklės ir ribinių verčių išraiška ir sprendimas

GB/T 14699.1 pašarų mėginių ėmimas (GB/T 14699.1 – 2005, ISO 6497: 2002, IDT)

GB/T 20195 gyvūnų pašarai: mėginio paruošimas (GB/T 20195 – 2006, ISO 6498: 1998, IDT)

3. Skiedikliai, terpės ir reagentai

Jei nenurodyta kitaip, analizei turi būti naudojami tik analitiškai gryni reagentai ir distiliuotas arba dejonizuotas arba lygiavertis grynas vanduo.

3.1.  0,85% sterilizuotas fiziologinis tirpalas

3.2.  Maistinė agaro (NA) terpė, žr. A priedo A.1

3.3.  Gramo dažymo tirpalas, žr. A priedo A.2

3.4.  7 % natrio chlorido auginimo terpė, žr. A priedo A.3

3.5.  Terpės ir reagentų VP bandymas, žr. A priedo A.4

3.6.  Nitratų redukcijos terpė ir reagentai, žr. A priedėlio A.5

3.7.  D-manitolio fermentacijos terpė, žr. A priedėlio A.6

3.8.  Propionato naudojimo terpė, žr. A priedo A.7

4. Įranga ir stiklo dirbiniai

Be laboratorinės įrangos, paprastai naudojamos mikrobiologijoje, kita įranga ir stikliniai indai, išvardyti taip:

4.1.  Termostatinis inkubatorius: 37 ºC ± 1 ºC

4.2.  pH matuoklis, tikslumas ± 0,1 vieneto

4.3.  Stiklinė arba plastikinė Petri lėkštelė

4.4.  1 ml ir 10 ml žymėjimo pipetė, kurios mažiausia skalė atitinkamai 0,1 ml ir 0,5 ml

4.5.  Stiklu arba plastiku dengtas strypas

4.6.  Mikroskopas su 1000 kartų priartinimu

5. Mėginių ėmimas

Bandomieji pavyzdžiai yra tikri ir reprezentatyvūs. Mėginių ėmimo įrankiai, tokie kaip semtuvai, šaukštai, mėgintuvėliai, stiklainiai, žirklės ir kt., turi būti sterilizuoti.

Mėginiai turi būti kuo greičiau išsiųsti į mikrobiologinių tyrimų kambarį. Mėginių dydis ir ėmimo būdas turi būti įgyvendintas pagal GB/T 14699.1.

6. Mėginio paruošimas

Mėginio paruošimas turi būti įgyvendintas pagal GB/T 20195, o mėginys turi būti patikrintas kuo greičiau po paruošimo.

7. Veikimo procedūros

7.1. Mėginio paruošimas patikrinimui ir pradinis sustabdymas bei dešimt kartų praskiedimas.

Laikydamiesi aseptinių operacijų ir sąlygų, pasverkite 25 g (ml) mėginio, įpilkite 225 ml 0,85% sterilizuoto fiziologinio tirpalo, homogenizuokite 1-2 min. ir padarykite pradinę suspensiją santykiu 1:10. Tada ištraukite 1 ml pradinės suspensijos santykiu 1:10, įpilkite 9 ml 0,85% sterilizuoto fiziologinio tirpalo ir gerai išmaišykite, kad praskiedtumėte santykiu 1:100. Atsižvelgdami į bakterijų kiekį mėginyje, toliau skiedžiama dešimt kartų nuosekliai didėjančiu skiedimu.

7.2.  Inokuliacija ir kultūra

Pasirinkite 2–3 tinkamus skiedimus, palaikykite ir palaikykite 10 min 80 °C ± 1 °C temperatūros vandens vonioje, sterilia pipete ištraukite 0,1 ml ir pasėkite dvi maistinio agaro plokšteles (3.2). Dengimo lazdele užtepkite inokuliatą ant agaro paviršiaus kuo atidžiau ir greičiau. Dangos strypas neturi liesti Petri lėkštelės krašto. Kiekvienam indui naudokite sterilų dengimo strypą. Uždenkite dengtą Petri lėkštelę ir palikite kambario temperatūroje 15 min., kad agaras visiškai absorbuotų inokuliatą. Apverskite plokštelę ir įdėkite į inkubatorių 37 °C ± 1 °C temperatūroje 48 ± 2 valandoms.

7.3. Kolonijų skaičiavimas ir atranka

Po inkubacijos pasirinkite lėkštelę, kurioje kolonijų skaičius yra 30–300. Jeigu inde auga didelės dribsnių formos kolonijos, vadinasi, jis nedeklaruojamas naudoti. Tačiau, jei dribsnių formos kolonijos yra mažesnės nei pusė lėkštelės, o likusios pusės kolonijų pasiskirstymas yra labai vienodas, galite apskaičiuoti pusę kolonijų skaičiaus lėkštelėje ir padauginti rezultatą iš 2, kad parodytumėte bendras kolonijų skaičius lėkštelėje. Tipiškų Bacillus Subtilis kolonija yra šiurkšti, nepermatoma, neblizga, išsiplėtusiais kraštais, apvali arba banguota, netaisyklingos formos, pilkšvai baltos arba gelsvos išvaizdos. Galiausiai eksperimento patvirtinimui pasirinkite 5 kolonijas, turinčias šias charakteristikas.

7.4. Patvirtinimo testavimas

7.4.1. Apžvalga

Šiuo metu, jei komerciniuose biocheminio identifikavimo rinkiniuose arba biocheminio identifikavimo mėgintuvėliuose naudojama auginimo terpė yra tokia pati kaip terpė, naudota atliekant šio standarto patvirtinimo testus, šiuos rinkinius ar mėgintuvėlius galima naudoti pagal prekių instrukcijas šiam patvirtinimui atlikti. eksperimentas.

7.4.2. Padermės paruošimas

Iš Petri lėkštelės paimkite vieną koloniją, paskleiskite kultūrą ant maistinio agaro plokštelės ir kultivuokite 37 °C ± 1 °C temperatūroje 48 ± 2 valandas. Iš kiekvienos lėkštelės turi būti paimta bent viena gerai izoliuota būdinga kolonija, ištraukta juostelė ir perkelta ant agaro lėkštelės ir laikoma patvirtinamiesiems tyrimams.

7.4.3. Morfologinis stebėjimas

Pasirinktos išgrynintos kolonijos buvo tiriamos naudojant gramo dažymo mikroskopiją (3.3). Bacillus Subtilis ląstelės turi būti lazdelės formos, su ovalo formos sporomis, mezozojaus arba beveik mezozojaus, o cistos neturėtų būti labai išsiplėtusios.

7.4.4. Fiziocheminis patvirtinimo testas

Išgrynintos kolonijos buvo atrinktos tirti: 7% natrio chlorido augimą (3,4), VP tyrimą (3,5), nitratų redukciją (3,6), D-manitolio fermentaciją (3,7) ir propionato panaudojimą (3,8).

7.4.5. Rezultatų patvirtinimas

Rezultatų patvirtinimas pateikiamas žemiau:

1. Bacillus Subtilis kolonijos yra šiurkščio paviršiaus, nepermatomos, pilkšvai baltos arba gelsvos išvaizdos, lazdelės formos su ovaliomis sporomis, mezozojaus arba beveik mezozojaus, su cistomis, kurios nėra reikšmingai išsiplėtusios.

2. Tyrimo rezultatai teigiami 7% natrio chlorido augimui, VP tyrimui ir nitratų mažinimui.

3. Rūgštis gali būti gaminama fermentuojant D-manitolį.

4. Jis gali būti vertinamas ir nustatytas kaip Bacillus Subtilis nenaudojant propionato.

Skiriamos Bacillus Subtilis ir Bacillus panašių bakterijų savybės pateiktos 1 lentelėje.

1 lentelė. Skiriamieji Bacillus Subtilis ir Bacillus tipo bakterijų požymiai

8. Rezultatų apskaičiavimas ir ataskaita

8.1.  Bacillus Subtilis kolonijų skaičiaus apskaičiavimas kiekviename patiekale.

Apskaičiuokite Bacillus Subtilis kolonijų skaičių (a) ant kiekvieno patiekalo naudojant formulę 1:

Formulė 1

a =(b ÷ A) x C

Legenda:

a:Bacillus Subtilis kolonijų skaičius ant kiekvieno patiekalo;

b:Kolonijų skaičius, patvirtintas kaip Bacillus Subtilis kolonijos po mėginio atrinkimo;

A:Patvirtinti pasirinktų kolonijų skaičius (5);

C:Kolonijų skaičius ant patiekalo, kuris įkūnija skiriamuosius bruožus Bacillus subtilis

Galutinis rezultatas (a) turėtų būti suapvalintas iki artimiausio sveikojo skaičiaus pagal GB/T 8170 skaitinio apvalinimo taisykles.

Pavyzdžiui:

Jei ant lėkštelės iš viso yra 78 kolonijos, pasižyminčios Bacillus Subtilis savybėmis, 5 atrenkamos patvirtinimo tyrimui ir 4 iš jų yra Bacillus Subtilis kolonijos, tada:

a= (4/5) x 78 = 62,4

a= 62,4 ~ 62

Pagal skaičių apvalinimo taisykles GB/T 8170, Bacillus Subtilis kolonijų skaičius (a) ant šio patiekalo yra 62.

8.2.  Bacillus Subtilis kolonijų skaičius mėginyje: skaičiavimo metodas ir ataskaita

Pasirinkite 2 nuoseklaus skiedimo indus (kiekviename skiedime turi būti bent vienas indelis, o patvirtintas Bacillus Subtilis skaičius ant lėkštelės yra 30–300), apskaičiuokite pagal formulę 2, kuri yra 1 ml arba 1 g Bacillus Subtilis mėginyje. , N.

Formulė 2

N = Ʃa / V (n₁ + 0,1n₂) · d

Legenda:

N:Bendras Bacillus Subtilis skaičius mėginyje;

Ʃa:Bendra patvirtintų Bacillus Subtilis ant visų patiekalų suma;

IN:Lėkštelės inokuliacijos tūris, ml;

n₁:Indų skaičius pirmam skiedimui;

n₂:Indų skaičius antrajam skiedimui;

d:Pirmojo praskiedimo praskiedimo koeficientas (vertėdneskiestiems mėginiams yra 1).

Galutinį rezultatą (N) reikia suapvalinti iki artimiausių 2 reikšminių skaitmenų pagal GB/T 8170 skaitinio apvalinimo taisykles. Bacillus Subtilis kolonijų skaičius mėginyje taip pat gali būti užregistruotas naudojant mokslinį žymėjimą (1,0–9,9 karto 10).^x).

Nurodykite apskaičiuotą Bacillus Subtilis skaičių viename ml arba g mėginio, KSV/g arba KSV/ml.

1 pavyzdys:

Jei po pirmojo praskiedimo (10^-3), patvirtintas Bacillus Subtilis kolonijų skaičius yra atitinkamai 168 ir 215, o po antrojo praskiedimo (10^-4), patvirtintas Bacillus Subtilis kolonijų skaičius yra atitinkamai 34 ir 35, tada:

N = (168 + 215 + 34 + 35) / [0,1 x (2 + 0,1 · 2) x 10^-3]

N = 472 / 0,00022

N = 2145450 ~ 2100000

Pagal GB/T 8170 pateiktas skaitmeninio apvalinimo taisykles, šiame pavyzdyje apskaičiuotas Bacillus Subtilis skaičius g arba ml vienetais yra 2100000 KSV/g (arba ml) arba 2,1 x 10⁶ KSV/g (arba ml).

2 pavyzdys:

Jei paskutinis praskiedimas (10^-4) patvirtina, kad Bacillus Subtilis kolonijų skaičius yra atitinkamai 120 ir 130, tada:

N = (120 + 130) / (0,1 x 2 x 10^-4)

N = 250 / 0,00002

N = 12500000 ~ 12000000

Pagal GB/T 8170 skaitines apvalinimo taisykles, šiame pavyzdyje apskaičiuotas Bacillus Subtilis skaičius g arba ml vienetais yra 12000000 KSV/g (arba ml) arba 1,2 x 10⁷ KSV/g (arba ml).